La exposición magnética con samario cobalto (SmCO5) aumentó la proliferación y la troncalidad de las células madre mesenquimales del cordón umbilical humano (hUC).

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 8904 (2022) Citar este artículo

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A pesar de los extensos informes sobre el peligro potencial de la exposición a campos magnéticos (MF) en humanos, también hay informes simultáneos sobre la propiedad proliferativa mejorada de las células madre con una exposición óptima. Sin embargo, el efecto sobre las células madre mesenquimales (MSC) sigue siendo desconocido. Por lo tanto, nuestro objetivo fue investigar el impacto de la MF estática inducida (SMF) en las células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano (hUC-MSC) utilizando samario cobalto (SmCO5). En el pase 3, las hUC-MSC (1 × 104) se expusieron a 21,6 mT SMF mediante una exposición directa (DE) y mostraron un recuento de células significativamente mayor (p < 0,05) en los ensayos de cinética de crecimiento con el tiempo de duplicación de población más corto en relación con la exposición indirecta. exposición y control negativo. El grupo DE se comprometió en el ciclo celular con un aumento de la fase S (55,18 ± 1,38 %) y la fase G2/M (21,75 ± 1,38 %) en relación con el grupo NC [fase S (13,54 ± 2,73 %); fase G2/M (8,36 ± 0,28%)]. Aunque no se observaron cambios significativos en el inmunofenotipo, el grupo DE mostró una expresión elevada de marcadores asociados a la pluripotencia (OCT4, SOX2, NANOG y REX1). Estos resultados sugieren que las MF podrían inducir potencialmente la proliferación de MSC, un enfoque prometedor para promover la propagación de células madre para la terapia clínica y la investigación sin comprometer la troncalidad de las hUC-MSC.

Los últimos años han sido testigos de un avance sustancial en nuestra comprensión de la biología de las células madre adultas humanas que se ha reflejado en un aumento de su uso terapéutico tras la mejora de la eficacia clínica informada. Desde la terapia basada en células1,2, el desarrollo de órganos bioartificiales3,4 y la reparación de tejidos de heridas a través de la regeneración rápida de tejidos5,6,7 hasta el tratamiento de varios tipos de cáncer8,9, la adopción de células madre adultas humanas a través del trasplante de células madre ha ganó una amplia popularidad atribuida a su riesgo mínimo de rechazo del huésped y efectos secundarios a pesar de su alta potencia terapéutica.

Las células madre mesenquimales (MSC) producidas en la médula ósea (BM) se consideran los tejidos de origen adulto más comunes y utilizados durante más tiempo para las MSC humanas. Otra fuente adulta de MSC "adultas" son los tejidos del cordón umbilical y la placenta, que a menudo se desechaban al nacer10. Poseen altas propiedades de autorrenovación y gran potencial de diferenciación11. Se ha demostrado que las MSC pueden dar lugar a células de linajes mesodérmicos como hueso, tejido adiposo, cartílago, tendón y músculo esquelético12,13,14. Varios informes han demostrado que las MSC también se diferencian potencialmente en varios tejidos de linaje no mesodérmico, incluidas las células de los islotes pancreáticos15, el músculo cardíaco16, los hepatocitos17 y las células neurales18. En comparación con otras células madre adultas específicas de tejido, las MSC son un agente terapéutico preferido debido a la capacidad de localización dirigida al sitio de las lesiones y la capacidad de diferenciarse en muchos tipos diferentes de células mesenquimatosas y parenquimatosas19. Las MSC también poseen propiedades reparadoras e inmunosupresoras únicas, ya que secretan grandes cantidades de citocinas/factores proangiogénicos, antiinflamatorios y antiapoptóticos que pueden ser responsables de la inducción de la regeneración tisular, la tolerancia al trasplante y el control de la autoinmunidad20,21. Atribuida a las propiedades de privilegio inmunitario de las MSC que les permiten evadir la respuesta inmunitaria del huésped, la terapia intravascular que implica la intervención de las MSC sigue siendo un procedimiento clínico de bajo riesgo. Es posible que se realicen más estudios para evaluar la dosificación y el método de administración óptimos para las MSC, ya que este factor, además de otros factores predisponentes relacionados con la respuesta inmunitaria del huésped, puede desempeñar un papel importante en la dirección del resultado clínico final de la terapia.

Sin embargo, las CMM con potencial terapéutico solo pueden aprovecharse determinando las condiciones óptimas necesarias para estimular fácilmente su proliferación y propagación continua con fines terapéuticos y de investigación22,23,24,25. El tejido del cordón umbilical proporciona una fuente limitada de células recién aisladas y, aunque los estudios han sugerido que las MSC del cordón umbilical humano (hUC-MSC) exhiben una mayor capacidad proliferativa en relación con las MSC de la médula ósea o el tejido adiposo26,27, existe la necesidad de estudios posteriores. expansión in vitro a gran escala sin modificar su troncalidad y capacidad de diferenciación. Por lo tanto, el desafío es determinar una condición óptima de cultivo que pueda favorecer la gran expansión de hUC-MSC para satisfacer la demanda clínica.

En general, los seres humanos y otros seres vivos están expuestos naturalmente a la MF de la Tierra, que no es dañina, así como a otras fuentes de MF inofensivas que se pueden obtener de materiales magnetizados conocidos como imanes permanentes. La clave para comprender la dicotomía entre formas dañinas e inofensivas de MF radica en la clasificación de los MF en función de sus fuentes. Los MF son básicamente de dos tipos, a saber, los campos endógenos y exógenos. Los campos endógenos son aquellos MF que se producen dentro del cuerpo. Este tipo de MF ocurre en varios órganos eléctricamente excitables como el corazón28,29,30, el cerebro31,32 y el ojo33. El estudio también indicó que los MF afectaron el rendimiento del sistema musculoesquelético34. Por otro lado, los campos exógenos son MF producidos por fuentes fuera del cuerpo y pueden clasificarse como campos exógenos naturales como el campo geomagnético de la Tierra (por ejemplo, Samarium Cobalt (SmCo5) o Neodymium Ferum Boron (NdFeB)) o exógenos artificiales (man fabricados) MF como líneas eléctricas, transformadores, electrodomésticos, transmisores de radio y dispositivos médicos35,36. Muchos investigadores han identificado MF exógenos artificiales y la forma de MF que presenta efectos dañinos y peligrosos graves para los humanos y otros seres vivos en exposición prolongada o frecuente. La exposición humana frecuente a los MF ha planteado graves problemas de salud, ya que el MF se ha asociado con algunas complicaciones médicas. Varios tipos de cáncer37, tumores38, glioblastoma39,40 y leucemia41 se han asociado con la exposición a MF. Dado que los seres humanos se enfrentan a riesgos constantes de exposición a formas nocivas de MF en las actividades cotidianas en el lugar de trabajo, el hogar, el metro y otros lugares públicos, los investigadores se han centrado más en explorar los efectos nocivos de los MF y, como tal, han desarrollado técnicas para la generación y manipulación de MF exógenos artificiales que imitan estas exposiciones diarias según lo informado por Zanella35. Curiosamente, un estudio concluyó que la exposición óptima a MF durante un corto período de tiempo definido podría promover de manera sorprendente y significativa el crecimiento celular. Desde entonces, se han realizado muchos estudios y se han informado37 efectos favorables de la exposición a MF, como la curación acelerada de fracturas óseas y la detención de la osteoporosis42,43,44. En consecuencia, nuestro estudio tuvo como objetivo investigar el impacto potencial del campo magnético estático inducido (SMF) en las tendencias proliferativas de las células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano utilizando SmCo5. SmCo5, cuya fuerza de imán es superada solo por el imán de NdFeB, se eligió como fuente magnética en este experimento porque posee un fuerte momento de magnetización permanente y es estable contra la influencia de la desmagnetización. También es adecuado para experimentos a temperaturas relativamente altas y es resistente a la oxidación, por lo que no se necesita ningún tratamiento de superficie, como revestimiento o sellado45,46. En este estudio, se diseñó un modelo controlable de SmCo5 como fuente de MF y proporciona una simulación de esos efectos a largo plazo en un tiempo relativamente corto. El objetivo del presente estudio es encontrar el sistema de cultivo óptimo investigando los efectos de la exposición de SMF SmCo5 en la proliferación, tasa de crecimiento y expresión génica de hUC-MSC con el objetivo de identificar la exposición a MF como una técnica alternativa para aumentar la proliferación. capacidad de MSC sin alterar las propiedades de MSC. Hacia esto, proporcionamos una base esencial antes de cualquier futuro experimento in vitro de SMF SmCo5.

La observación de la morfología celular se registró en el pase de 3 hUC-MSC cultivadas desde el día 0 hasta el día 10 como se presenta en la Fig. 1. Tanto para los grupos de prueba (DE e IE) como para el grupo de control (NC), las células adherentes fueron observado en el día 2 con las células manteniendo la forma de huso similar a fibroblastos alargados, una característica de las MSC sanas. Aunque la morfología en forma de huso se mantuvo en ambos grupos, hasta el día 10, hubo diferencias notables en el tiempo que necesitaron para alcanzar el 100 % de confluencia. Mientras que el grupo DE alcanzó el 100 % de confluencia en el día 8 de cultivo, la confluencia celular en los grupos IE y NC fue aproximadamente del 80 %. Sin embargo, la confluencia permaneció sin cambios en el grupo IE pero mejoró notablemente en el grupo NC después del cultivo hasta el día 10 (Fig. 1).

Observaciones morfológicas de las hUC-MSC. Observación de la morfología celular del pase 3 hUC-MSCs en los grupos DE, IE y NC. Todas las células exhibieron la característica forma de huso similar a los fibroblastos MSC con el grupo DE logrando una confluencia del 100 % en el día 8, mientras que el grupo IE tuvo la menor confluencia incluso después del día 10. El grupo NC logró una confluencia del 100 % en el día 10. Todas las micrografías fotográficas fueron tomado con el microscopio invertido CKX41 (Olympus, Japón) con un aumento de 100X.

Los resultados obtenidos de la cinética de crecimiento mostraron que las células en los grupos de prueba y de control exhibieron un patrón de crecimiento similar que comenzó con la fase de retraso, siguió con la fase de crecimiento exponencial y terminó en la fase estacionaria Fig. 2a. Aunque la fase de latencia duró hasta el día 4 y la fase exponencial alcanzó su punto máximo en el día 10 en los grupos DE, IE y NC, hubo un aumento significativo en el recuento de células en el grupo DE (3,13 × 104 ± 0,11) en comparación con el grupo NC ( 2,66 × 104 ± 0,21 células). Se observó una disminución significativa en el recuento de células en el grupo IE (1,47 × 104 ± 0,15 células) en comparación con el grupo NC. Sin embargo, en el día 10, cuando la fase exponencial alcanzó su punto máximo, no hubo diferencias significativas entre el grupo DE y NC, mientras que se observó una caída significativa en el recuento de células en el grupo IE (es decir, IE [9,42 × 104 ± 0,56 células] contra NC [ 12,4 × 104 ± 0,55 celdas]) como se muestra en la Fig. 2b. También se observó que al alcanzar el pico de la fase exponencial, las células de ambos grupos de prueba, así como el control, sufrieron una fuerte disminución en el crecimiento (Fig. 2a) en lugar de la fase de meseta, como se esperaba en la fase estacionaria de crecimiento. cinética. En el análisis del tiempo de duplicación de la población (PDT) realizado en las hUC-MSC del paso 1 al paso 6, hubo una disminución en el PDT a medida que la célula se expandía al paso 4, después de lo cual se estabilizó hasta el paso 6. Curiosamente, el PDT de células en el grupo IE fue mayor en relación con la de los grupos DE y NC a lo largo del paso 1 a 6 con un aumento estadísticamente significativo (p < 0,05) en el grupo IE en comparación con el NC registrado en el paso 3. No hay diferencia significativa sin embargo, entre el PDT de células en el grupo DE y las del grupo NC (Fig. 2c).

Cinética de crecimiento de las hUC-MSC que muestra el efecto de la exposición directa e indirecta a MF de las células muertas. ( a ) Las células en los grupos directos y de control exhibieron un patrón de crecimiento similar que comenzó con la fase de retraso, seguida de la fase de crecimiento exponencial en el día 4-10 y terminó con la fase estacionaria. (b) Las comparaciones del recuento de células en el día 4 (Duración de la fase de latencia) y el día 10 (Pico de la fase exponencial) entre los grupos DE, IE y NC.* muestra un aumento estadístico significativo en comparación con el control (NC), mientras que # muestra un aumento estadístico disminución significativa en comparación con el control (NC) (p < 0,05). ( c ) Tiempo de duplicación de la población (PDT) de la MF expuesta (DE e IE) así como del control (NC) hUC-MSC del paso 1 al paso 6. El PDT disminuyó a medida que la célula se expandió al paso 4 después de lo cual se estabilizó hasta el sexto pasaje. * muestra un aumento estadísticamente significativo en el recuento de células en comparación con el control (NC). Sin embargo, no hubo diferencia significativa entre la TFD de las células del grupo DE y las del grupo NC (p < 0,05).

La caracterización de las hUC-MSC que se realizó mediante la evaluación de la expresión de marcadores de superficie celular después de la exposición a MF indicó que, con la excepción de CD105, el MF no altera completamente la integridad inmunofenotípica de las células incluso después de 72 h de incubación del cultivo. Los resultados revelaron que las células de los tres grupos exhibieron expresión negativa para marcadores inmunológicos y hematológicos i. CD14, CD80, CD86 y HLA DR, DP, DQ junto con una expresión positiva de marcadores MSC ii. CD29, CD73, CD105 y HLA-ABC (Fig. 3a-e) Los anticuerpos se adquirieron de Benton Dickinson excepto CD105 que se adquirió de R&D system (Tabla 1). Además, no hubo diferencia significativa en los niveles de expresión de los marcadores de superficie celular entre el grupo DE e IE en comparación con el grupo NC. Como se presenta en la Fig. 3a, más del 90% de las células en el grupo DE tienen expresión positiva para CD29, CD73 y HLA-ABC con un porcentaje menor positivo para CD105 (37,4%). Se observó una tendencia similar en el grupo IE (Fig. 3b) que mostró > 90 % de expresión positiva para CD29 y CD73 con la excepción de HLA-ABC y CD105 con 84,2 % y 47,9 % de expresión positiva respectivamente. Finalmente, más del 90% de las células del grupo NC (Fig. 3c) han expresado CD29, CD73 y HLA-ABC excepto CD105 donde el porcentaje es del 62,6%. Las células de los tres grupos tenían menos del 1 % de expresión de CD14, CD80 y CD86 y HLA-DR. Dado que las hUC-MSC han sido positivas para la expresión de MSC incluso después de haber sido expuestas a SMF, se puede concluir que SMF SmCo5 no contribuye a ningún efecto significativo o cambió el inmunofenotipo de las hUC-MSC incluso después de 72 h de cultivo en un entorno de MF. Aunque hubo una reducción significativa en la expresión de CD105, MF no condujo a ninguna diferencia significativa en el fenotipo de superficie de las MSC después del tratamiento (Fig. 3d, e).

( a ) Panel de control y expresión de marcadores de superficie celular en los hUC-MSC expuestos directamente (DE). Las células exhibieron más del 90 % de expresión positiva para CD29, CD73 y HLA-ABC con un menor porcentaje positivo para CD105, es decir, solo el 37,4 %, mientras que se observó menos del 1 % de expresión para CD14, CD80 y CD86 y HLA-DR. (b): panel de control y expresión de marcadores de superficie celular en las hUC-MSC expuestas indirectamente (IE). Las células exhibieron más del 90 % de expresión positiva para CD29, CD73 y HLA-ABC con un porcentaje menor positivo para CD105, es decir, solo el 47,9 %, mientras que se observó menos del 1 % de expresión para CD14, CD80 y CD86 y HLA-DR. ( c ) Panel de control y expresión de marcadores de superficie celular en los hUC-MSC de control (NC). Las células exhibieron más del 90 % de expresión positiva para CD29, CD73 y HLA-ABC con un menor porcentaje positivo para CD105, es decir, solo el 62,6 %, mientras que se observó menos del 1 % de expresión para CD14, CD80 y CD86 y HLA-DR. (d): el resultado muestra que la expresión de las proteínas marcadoras de la superficie celular CD29, CD73 y HLA-ABC son similares entre DE e IE en comparación con NC, mientras que la endoglina (CD105) disminuye significativamente en los grupos DE e IE en comparación con NC grupo. * muestra un grupo estadísticamente significativo en comparación con el control negativo. ( e ) El resultado muestra el patrón de expresión similar de marcadores hematológicos e inmunológicos en MSC sin diferencias significativas entre los grupos. ( f ) Diferenciación de hUC-MSC en osteocitos. Las MSC se cultivaron hasta la confluencia y se estimularon para diferenciarse en osteocitos usando un medio apropiado durante un total de 21 días. Según un experimento de tinción citoquímica, las hUC-MSC tratadas con ambos grupos de prueba (DE, IE) pudieron convertirse en células osteogénicas. El depósito de calcio teñido con Alizarin Red S reveló diferenciación osteogénica. Todas las micrografías fotográficas se tomaron con el microscopio invertido CKX41 (Olympus, Japón) con un aumento de 100X.

En la investigación preliminar del estudio de diferenciación, los grupos hUC-MSC de DE e IE se cultivaron hasta la confluencia y se sometieron a diferenciación osteogénica. Las células se incubaron en un medio de inducción osteogénica durante 21 días usando un kit de ensayo de diferenciación osteogénica MSC disponible comercialmente. Las hUC-MSC de ambos grupos de prueba pudieron experimentar una diferenciación osteogénica y expresaron marcadores osteogénicos que se visualizaron mediante tinción citoquímica. El depósito de calcio como signo de diferenciación osteogénica reveló una tinción de color rojo vivo cuando las células se cultivaron en medios inductivos osteogénicos y se tiñeron con Alizarin Red S (Fig. 3f)).

Dado que SMF SmCo5 podría mejorar la proliferación en fase exponencial, se realizaron más experimentos para investigar el contenido de ADN de hUC-MSC a través del ciclo celular. Como se muestra en la Fig. 4a, nuestros hallazgos mostraron que después de 18 h, el mayor número de células tratadas con MF mostró una mayor intensidad de señal de PI observada después en la fase S y G2/M (55,18 % y 21,75 % respectivamente) en relación con IE y NC, lo que sugiere que el grupo DE se comprometió con la fase S y G2/M. Finalmente, factores como la fuerza de MF de 21,6 mT y los períodos expuestos de MF que oscilan entre 18 y 30 h para hUC-MSC no parecen desempeñar un papel significativo en el ciclo celular de NC. Por lo tanto, este hallazgo sugiere que las hUC-MSC tratadas con DE SMF son una condición óptima que permite que las hUC-MSC avancen hacia el ciclo celular (tan pronto como 18 h). La comparación entre 18, 24 y 30 h se puede ver en la Fig. 4b–d.

( a ) Distribución de ADN que muestra el análisis del ciclo celular de los hUC-MSC expuestos a MF (DE e IE), así como el control (NC) después de 18, 24 y 30 h de cultivo. Las células en el DE fueron las primeras en progresar en el ciclo celular (a las 18 h) ya que la fase G0/G1 disminuyó notablemente mientras que las fases S y G2/M aumentaron. La tendencia fue seguida por el grupo IE a las 24 h, mientras que el grupo NC se retrasó hasta las 30 h. Comparación gráfica entre las fases del ciclo celular de los grupos DE, IE y NC. (b) La imagen muestra la disminución de la fase G0/G1 y el aumento de las fases S- y G2/M en el grupo DE en relación con el grupo NC después de 18 h de cultivo. ( c ) Muestra la disminución de la fase G0 / G1 y el aumento de las fases S y G2 / M en el grupo IE en relación con el grupo NC después de 24 h de cultivo, mientras que ( d ) muestra que no hubo diferencia significativa en las fases del ciclo celular entre los grupos expuestos y de control. * Muestra un aumento estadísticamente significativo en el porcentaje de células en comparación con el control (NC), mientras que # muestra una disminución estadísticamente significativa en el porcentaje de células en comparación con el control (NC) (p < 0,05).

Se realizó una electroforesis en gel de agarosa producto de la reacción de polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) para determinar la expresión de los genes OCT4, SOX2, NANOG y REX-1 que representan marcadores de tallo inducidos y se expresan principalmente en células indiferenciadas de hUC-MSC. En general, las muestras tratadas (DE) exhibieron una mayor expresión de estos genes en comparación con los controles (IE y NC) Fig. 5a. A partir de la Fig. 5b, se mostró que el grupo DE condujo a un aumento significativo en la expresión de NANOG (2,73 veces), en relación con IE. No se observó una diferencia significativa de la expresión de OCT4, SOX2 y REX1 entre los grupos DE e IE, aunque la exposición a MF al grupo DE pareció tener un ligero aumento en la expresión de OCT4 en comparación con los grupos IE. Estos resultados mostraron que la exposición a MF no reduce la expresión de estos genes marcadores, sino que, en cambio, podría mantener las propiedades de tallo de las hUC-MSC (archivo complementario).

Expresión génica de marcadores asociados a pluripotentes (OCT4, SOX2, NANOG y REX-1) en hUC-MSC expuestas a MF. ( a ) El producto de RT-PCR en la electroforesis en gel de agarosa realizada para determinar la intensidad de expresión de los marcadores expresados principalmente en MSC no diferenciadas. ( b ) Cambio de pliegue que muestra la regulación positiva de OCT4 en los grupos DE e IE con niveles de expresión más altos en el grupo DE en relación con el grupo IE. El gen SOX2 se reguló significativamente a la baja en los grupos DE e IE, mientras que NANOG se reguló significativamente en DE (cambio de 2,73 veces) en relación con los grupos IE.

En este estudio, los resultados observados son indicativos de los potenciales de MF en la mejora de la proliferación in vitro de hUC-MSC. Los efectos de MF se observaron por primera vez en las propiedades morfológicas de las hUC-MSC. Aunque la investigación mostró que no se observaron diferencias morfológicas visibles entre los grupos DE, IE y control (NC), hubo una mejora notable en la velocidad a la que se logra la confluencia. Además, las células tratadas con MF mostraron una morfología similar a las células no tratadas (NC), ya que mantuvieron la apariencia y la morfología típicas de las hUC-MSC sanas (similares a fibroblastos y con forma de huso), lo cual está de acuerdo con los estudios informados por Marędziak et al.47, y Du et al.48. Esto, por lo tanto, sugiere que la exposición directa a MF puede proporcionar un método potente para aumentar la velocidad de propagación mientras se mantienen estructuras morfológicas normales. El resultado positivo del análisis del tiempo de la cinética de crecimiento respalda aún más la inferencia realizada a partir de las observaciones morfológicas. Las células DE exhibieron un recuento de células más alto en el día 4, en relación con IE y NC, donde se inició la fase exponencial, lo que sugiere que la exposición a MF mejora notablemente la cinética de crecimiento de las hUC-MSC y, por lo tanto, ayuda a tiempo con la propagación in vitro. Nuestra observación en este aspecto contrastó con otros 3 estudios. En primer lugar, Wiskirchen et al.49 revelaron que la cinética de proliferación no se alteraba por la exposición a MF y que la exposición repetitiva a un campo magnético estático (SMF) de 0,2, 1,0 y 1,5 T no ejercía efectos sobre la proliferación de células de fibroblastos pulmonares fetales humanos (HFLF). después de 21 días. De manera similar, Miyakoshi50 informó hallazgos contrastantes en los que no hubo alteración en la cinética de proliferación después de que las células se expusieran al MF. En tercer lugar, Sun et al. demostraron que el análisis cinético de las células madre mesenquimales de médula ósea (BMMSC) durante la fase de crecimiento exponencial no se vio afectado significativamente por el campo electromagnético pulsado (PEMF)43. En contraste con sus hallazgos, nuestro estudio ha alterado con éxito la cinética de crecimiento, principalmente quizás contribuida por el método de exposición magnética, así como por las fuentes de células utilizadas para las exposiciones a campos magnéticos. Además de la observación mencionada anteriormente, el tiempo de duplicación de la población disminuyó el aumento del número de pases en los grupos de prueba y de control. Sin embargo, se observó un tiempo de duplicación más corto en los grupos DE en comparación con los grupos IE y NC. Esta observación está de acuerdo con la observación de Marędziak et al.51, donde informaron que la tasa de proliferación más alta se observó en células madre estromales mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano (hASC) cultivadas en presencia de condiciones de MF y multiplicadas con la PDT más corta. Por el contrario, Sadri et al.52 informaron de hUC-MSC tratadas con SMF a 18 mT y descubrieron que SMF hizo que la TFD fuera más larga en comparación con el grupo de control. Aquí, hemos demostrado con éxito que una exposición directa de MF al hUC-MSC a 21,6 mT SMF es una condición óptima para aumentar la proliferación celular con el PDT más corto.

La caracterización de las hUC-MScs tras la exposición a MF se llevó a cabo mediante el análisis de los marcadores de superficie celular que demostraron que los marcadores de CD de los grupos DE e IE no eran diferentes en comparación con el grupo NC de control. Los resultados mostraron que las células exhiben fenotipos similares a las células madre mesenquimales incluso después de 72 h de cultivo en un entorno expuesto a MF. Las MSC constituyen una población heterogénea de células, en cuanto a su morfología, fisiología y expresión de antígenos de superficie. Hasta ahora, no hay marcadores de superficie celular específicos únicos identificados y generalizados para las MSC. En este estudio, hemos demostrado que las hUC-MSC aisladas mediante citometría de flujo eran homogéneas sin contaminación de las células madre hematopoyéticas y sus progenitores. Esto fue confirmado por nuestros datos experimentales de inmunofluorescencia que representaron los marcadores positivos CD29, CD73, CD105 y HLA-ABC, y contra la falta de expresión de los marcadores negativos CD14 y HLA-DR y los marcadores coestimuladores CD80, CD86 en los cultivos. Sin embargo, es importante señalar que los niveles de expresión de CD105 disminuyeron significativamente en los grupos expuestos, es decir, DE e IE. La expresión reducida de CD105 en DE e IE en relación con NC sugiere una posible alteración de su destino celular. Si la disminución observada podría estar asociada con una función biológica suprimida o mejorada, esto justifica una mayor investigación. Aparte de CD105, no hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de los marcadores de superficie celular entre los expuestos y los controles. Sun et al.43 obtuvieron resultados similares, ya que informaron que la exposición a MF no afecta significativamente la morfología del fenotipo de la superficie observada y el potencial de diferenciación de múltiples linajes para las BM-MSC. Dado que las hUC-MSC han sido positivas para la expresión de las MSC (adherencia a la superficie y expresiones de la superficie celular) incluso después de haber sido expuestas a MF, se puede concluir que la MF no contribuye a ningún efecto significativo o cambió el inmunofenotipo hUC-MSC por parte de la MF, incluso después de 72 h de cultivo en ambiente MF.

Cuando se cultivaron en un medio de inducción osteogénica, las hUC-MSC generadas por cultivo se diferenciaron en osteocitos según la tinción citoquímica. Específicamente, la morfología innata similar a los fibroblastos de las MSC ha cambiado a formas similares a las de un cuboide durante la osteogénesis inducida. Cuando estas células se tiñeron con rojo de alizarina, parecían tener un color rojo ladrillo debido a la agregación celular y la formación de nódulos. Una región particular del pigmento de tinción parecía más densa y se cree que es la deposición de calcio, un indicador común de osteogénesis. Los resultados del estudio actual son similares a los estudios realizados por53,54,55. Sin embargo, se debe realizar una mayor caracterización de la osteogénesis para validar esta observación a fondo. Por ejemplo, el contenido de calcio de estas células se puede evaluar más mediante un ensayo colorimétrico y se puede utilizar RT-qPCR para identificar la presencia de marcadores de osteocitos. Además, el análisis de transferencia Western puede evaluar la presencia de proteínas relacionadas con la osteogénesis. Nuestros hallazgos preliminares aquí respaldan la idea de que SMF SmCo5 no afecta el potencial de diferenciación multipotente de las hUC-MSC, particularmente el potencial osteogénico.

Los ensayos de proliferación que utilizan técnicas como MTT y ciclo celular han demostrado una mayor proliferación de MSC después de la exposición a MF51,52,56. Nuestro resultado mostró que las células en el grupo DE se comprometieron en el ciclo celular tan pronto como 18 h de cultivo en comparación con los grupos IE y NC. Con el tiempo, las hUC-MSC pueden experimentar senescencia celular en la que se detienen más células en la fase G0/G157. El envejecimiento de las células está estrechamente relacionado con la actividad de la telomerasa y la longitud de los telómeros. Aunque la longitud de los telómeros y la actividad de la telomerasa no se midieron en el estudio de presencia, la promoción de la progresión del ciclo celular y la disminución de la actividad de la apoptosis como lo indica el ciclo celular pueden representar indirectamente la actividad de la telomerasa. Esto sugiere que la MF intensificada puede inducir la supervivencia de las hUC-MSC o que la MF actúe como agente antiapoptótico para el mecanismo del ciclo celular de 6 a 48 h. Es posible que las células salgan del estado de reposo y sigan proliferando; y por lo tanto, el proceso de envejecimiento puede prevenirse mediante la exposición a MF. Para confirmar esto, se debe realizar una medición de la actividad de apoptosis, como los ensayos de caspasa, para una mayor investigación. Los resultados obtenidos mostraron que MF aumenta el número de células en la fase S y G2/M detectada como se observó en el grupo DE.

Nuestro análisis de expresión génica por RT-PCR reveló que la expresión de NANOG aumentó 2,73 veces en DE en relación con IE, en el pase 3. Esto está en consonancia con los hallazgos de Rinaldi et al.58, donde la exposición al transportador asimétrico radioeléctrico (REAC) causó 30 aumento de la expresión de NANOG en MSC, incluso en células en el paso 30. En consecuencia, esto indujo una regulación positiva de la expresión de Bmi1 que desempeña un papel central en la reparación del ADN y la autorrenovación de las células madre. Como tal, MF en el estudio puede facilitar la proliferación celular a través del aumento de NANOG como se observa con REAC. La expresión reducida del gen SOX-2 sugiere que se estaba formando una subpoblación de células más diferenciada en las células tratadas con DE en comparación con las células tratadas con IE y NC. Esta observación justifica el hecho de que el destino celular se ve afectado por SMF a través de algún fenómeno biológico que justifica más investigaciones.

El presente estudio reveló la destreza de MF de 21,6 mT de intensidad para estimular la proliferación in vitro y mejorar la propagación de hUC-MSC sin afectar su integridad inmunofenotípica. Sin embargo, esta destreza se puede explorar más a fondo mediante el análisis de los efectos de la exposición a MF en vías de señalización clave utilizando herramientas de biología computacional y evaluación genética global. Los estudios actuales estaban más orientados a descubrir el potencial fundamental de la exposición a MF en la expansión de las MSC. El aumento de la expresión génica de NANOG entre otros marcadores pluripotentes asociados, como OCT4, SOX2 y REX-1, puede indicar un evento adverso potencial, ya que dicha coexpresión de NANOG y OCT4 en publicaciones anteriores se había reflejado en un mal pronóstico de varias neoplasias malignas. incluidos los carcinomas de pulmón, glioma y células renales59,60,61,62. Por lo tanto, se realizará un estudio separado para profundizar en el tema con la esperanza de proporcionar una conclusión más concreta sobre su seguridad. La investigación adicional también incluiría varios estudios genéticos y metabolómicos, investigación sobre las exposiciones a MF con la troncalidad y el crecimiento de las células madre cancerosas y la implicación en el desarrollo del cáncer. Además, una observación importante realizada en el presente estudio es el bajo rendimiento de la exposición indirecta de MF hacia hUC-MSC, como se desprende de los resultados del grupo de células IE a lo largo del estudio. Aunque el grupo IE se introdujo como un control técnico, mostró que existe la posibilidad de un efecto indeseable al exponer las MSC a MF indirectamente. Sin embargo, se recomienda que se realicen estudios futuros que consideren la distancia de la fuente magnética hacia las propiedades biológicas de las MSC.

En el estudio se utilizó samario-cobalto, un imán de tierras raras hecho de aleación de samario y cobalto que ofrece una magnetización grande y permanente. El componente magnético constaba de dos cilindros magnéticos de samario-cobalto (SmCo5 o SmCo Serie 1:5). Cada cilindro magnético tenía un grosor de 4 cm y un diámetro de 9,5 cm recubierto de níquel para evitar el descascarillado y endurecer la superficie. Los cilindros magnéticos de SmCo5 se instalaron dentro de la incubadora de CO2 (Galaxy S., EE. UU.) con la ayuda de un posicionador ajustable con los polos norte y sur uno frente al otro. Dado que los imanes de SmCo5 son anisotrópicos, el MF se generó en una sola dirección. La figura 6a muestra la distribución esquemática de la intensidad de MF desde la superficie del imán permanente. La intensidad de MF más alta fue de 21,6 mT, se midió y registró usando un medidor de Gauss (DC Gaussmeter Modelo GM 1-ST, Tipo ALPHALAB Inc, EE. UU.), colocado encima de los cultivos celulares en el centro entre los imanes permanentes donde el MF fue completamente uniforme (Fig. 6b). La incubadora tiene tres compartimentos, es decir, los compartimentos superior, medio e inferior con el imán SmCo5 guardado en el compartimento inferior.

© es donde los MF son más uniformes e intensos. (b) Configuración que muestra cómo se colocaron las células en los grupos de exposición directa (DE) e indirecta (IE) en diferentes lugares de la incubadora. El grupo DE y el grupo IE están en la misma incubadora y el grupo de control negativo (NC) en una incubadora diferente.

(a) El diagrama esquemático anterior muestra la distribución de líneas MF entre un par de imanes de tierras raras. La región central entre los dos cilindros magnéticos.

Las hUC-MSC totalmente caracterizadas se obtuvieron del Grupo de investigación de células madre e inmunidad, Laboratorio de inmunología, Departamento de patología, Facultad de medicina y ciencias de la salud, Universidad de Putra, Malasia. Las MSC del cordón umbilical se derivaron de la gelatina de Wharton de los cordones umbilicales humanos. Los cordones umbilicales humanos se obtuvieron de partos a término en el Hospital de Mujeres y Niños Britannia, Kajang, Selangor, Malasia, después de obtener el consentimiento informado de todos los sujetos y/o sus tutores legales. La recolección y el uso de tejidos de cordón umbilical humano fueron aprobados por el Comité de Ética e Investigación de la Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud de la Universiti Putra Malaysia. Todos los métodos y procedimientos de uso de células humanas se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes, incluida la Declaración de Helsinki. Las células se cultivaron en F12 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM-F12) compuesto por Dulbecco GLUTAMAX (Gibco, Reino Unido) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (FBS), 1 % de penicilina/estreptomicina, 0,5 % de fungizona y 0,1 % de gentamicina ( Gibco, Reino Unido). El medio de cultivo optimizado para hUC-MSC se preparó recientemente como se describe en Tong et al.63. Según el diseño experimental, las celdas se agruparon en tres, i-el grupo DE se colocó en el centro entre los imanes permanentes donde la intensidad del MF 21,6 mT medida por el medidor de Gauss) era la más alta y uniforme; ii- el grupo IE se colocó en el compartimento superior de la misma incubadora que el grupo DE, mientras que iii- el grupo NC se colocó en una incubadora diferente libre de exposición a MF. La disposición de las células en la incubadora se basó en la configuración experimental y se presenta en la Fig. 6b. Todas las condiciones de cultivo en las incubadoras utilizadas se mantuvieron a 37 °C y se suministraron con 5% de CO2.

Las hUC-MSC se sembraron en una placa de Petri de 60 mm a 1 × 104 células y se cultivaron hasta el pase número 6. La morfología de las células se observó cada dos días utilizando un microscopio invertido CKX41 de contraste de fase (Olympus, Japón). Se registraron las imágenes obtenidas para los grupos de prueba (DE e IDE) y de control (NC) en el paso 3.

En el experimento de cinética de crecimiento, se sembraron 1 × 104 hUC-MSC en el pase 3 en una placa de Petri de 60 mm. Para cada grupo, las células se sembraron en diferentes placas de Petri durante 6 puntos de tiempo de incubación, los días 2, 4, 6, 8, 10 y 12. En la maduración de cada día de incubación, las células se recolectaron mediante tripsinización usando TrypLE™ Select Enzyme (ThermoFisher Scientific, EE. UU.) y se contaron mediante la prueba de exclusión de azul de tripano utilizando una solución de azul de tripano (Sigma-Aldrich, EE. UU.) para. Los datos se analizaron después de la enumeración. De manera similar, para el análisis del tiempo de duplicación, también se sembraron 1 × 104 hUC-MSC en el pase 3 en placas de Petri de 60 mm y se trataron en las mismas condiciones descritas anteriormente. Las células se recogieron mediante tripsinización usando TrypLE™ Select Enzyme (ThermoFisher Scientific, EE. UU.) y luego se contaron manualmente mediante un hemocitómetro bajo un microscopio. La tasa de crecimiento, que es inversa al tiempo de generación, se define como el número de células que se duplican por unidad de tiempo durante un intervalo de tiempo específico. El tiempo de duplicación se determinó mediante la fórmula de Patterson y se expresó como tiempo medio de duplicación.

Las hUC-MSC (2 × 105 células) en el paso 3 se cultivaron en matraces de cultivo de tejidos T-25 y se incubaron durante 72 h. Después de lograr una confluencia de aproximadamente 80 a 90 %, las células se recolectaron, contaron y 1 × 106 células se transfirieron a tubos de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). A continuación, las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1 × fría y se tiñeron con 1,5 μl por 105 células del panel de anticuerpos monoclonales antihumanos de MSC: como se indica en la Tabla 1. Las células teñidas se incubaron durante al menos 15 min a 2ºC. –8 °C. Después de eso, las células se lavaron y resuspendieron en 500 μL de PBS y los marcadores de superficie celular se detectaron mediante la adquisición de 104 células marcadas con anticuerpos utilizando un citómetro de flujo BD LSR FORTESSA (BD Bioscience, EE. UU.). Se usaron células marcadas con isotipo no específico conjugadas con fluorocromo y sin teñir como control paralelo a todas las mediciones para establecer una activación negativa. Los datos obtenidos se analizaron mediante el software Cell Quest Pro proporcionado por el fabricante (software Becton Dickinson CellQuest, EE. UU.).

Se analizó la capacidad de diferenciación osteogénica de las hUC-MSC del paso 3 como parte de la evaluación del potencial mesodérmico utilizando el kit de diferenciación de osteogénesis StemPro (Gibco, Invitrogen, EE. UU.). Para el grupo DE, se sembraron 10 000 células hUC-MSC en matraces T-25 complementados con medio completo de MSC y se incubaron a 37 °C y en condiciones de CO2 al 5 % hasta que se logró una monocapa de células confluentes. Al lograr la confluencia, el medio de cultivo celular se reemplazó con un medio de diferenciación osteogénica cada 3 días durante otros 21 días. Para el grupo de control, las células se mantuvieron en medio completo de MSC solo durante todo el estudio. Al final del día 21, las células se recogieron y se fijaron con etanol al 70 % durante 60 min. A esto le sigue la tinción con solución de rojo de alizarina durante 30 min. Todos los cultivos celulares se observaron bajo un microscopio invertido CKX41 de contraste de fase (Olympus, Japón), y se capturaron sus imágenes.

Las hUC-MSC se sembraron en placas de 6 pocillos a razón de 5 × 104 células por pocillo. Las células se agruparon en 3 puntos de tiempo diferentes (18, 24 y 30 h) y se incubaron en consecuencia. Después de cada período de incubación, las células se recolectaron, se lavaron en PBS frío y luego se fijaron con etanol al 70 % durante la noche a -20 °C. Luego, las células fijadas se lavaron dos veces y se suspendieron en 25 µl de 10 mg/ml de RNasa (Sigma-Aldrich, EE. UU.) y se incubaron con 500 µl de tampón de tinción que constaba de 1 mg/ml de tinción de yoduro de propidio (PI) (Molecular Probe, Invitrogen) se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. La distribución de ADN de la célula se analizó mediante la adquisición de células marcadas con 104 PI utilizando un citómetro de flujo BD LSR FORTESSA (BD Bioscience, EE. UU.). El análisis de los datos adquiridos se realizó utilizando el software ModFit LT (Verify Software House, EE. UU.).

Se consideraron todas las precauciones estándar en el manejo del ARN para evitar contaminaciones. El ARN total de los sedimentos celulares se extrajo con el kit RNeasy Mini (Qiagen, Alemania) según el protocolo del fabricante. El ARN extraído se eluyó hasta 50 µl con agua libre de ARNasa mediante centrifugación a 13.000 rpm durante 1 min. La concentración y la pureza del ARN se midieron con el espectrofotómetro Nano-Drop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., EE. UU.). El ARN (500 ng) se cargó en un pocillo de gel de agarosa al 1,5 % (Sigma Sigma-Aldrich, EE. UU.) y se sometió a electroforesis a 90 V durante 60 min. La integridad del ARN purificado se evaluó mediante la visualización de las bandas de ARN ribosomal 28S y 18S. El ADNc se generó utilizando el kit de transcripción inversa QuantiTect (Qiagen, Alemania) según el protocolo del fabricante. Se usó un microgramo (1 µg) de ARN purificado para generar el ADNc. El ADNc sintetizado se almacenó a -20 °C y se realizó una RT-PCR posterior utilizando un protocolo estándar de 40 ciclos. Esencialmente después de una desnaturalización inicial a 94 °C durante 10 min, 40 ciclos (desnaturalización a 94 °C durante 45 s, recocido a 58 °C durante 30 s, extensión a 72 °C durante 90 s) seguida de una extensión final a 72 ºC durante 5 min. Los amplicones de RT-PCR se separaron en un gel de agarosa al 2 % (SeaKem® LE Agarose, Lonza, Suiza) y se tiñeron con bromuro de etidio. El gel se visualizó utilizando Syngene Gel Documentation (Syngene, EE. UU.). El diseño de los cebadores GADPH, REX 1, SOX2 OCT4 y NANOG se adoptó del estudio anterior, tal como se presenta en la Tabla 2. La intensidad de la banda de los genes de interés obtenidos de la electroforesis en gel de agarosa del producto RT-PCR se cuantificó utilizando el Image J™, normalizado contra el gen de referencia (GADPH) y luego presentado como cambio de pliegue en referencia al grupo NC usando la fórmula a continuación.

Los resultados obtenidos de las células tratadas y las células de control en diferentes siembras de hUC-MSC mediante la prueba t de Student utilizando GraphPad Prism (Versión 7) y los niveles significativos se establecieron en un valor de p < 0,05.

Porcentaje

mas menos

Grado Celsius

timidina tritiada

Células madre mesenquimales de médula ósea

Ácido desoxirribonucleico complementario

Dióxido de carbono

Cuenta por minuto

Grupo de designación

Corriente continua

exposición directa

Águila modificada de Dulbecco mediana

Ácido desoxirribonucleico

Células madre adultas de equinos

Frecuencia extremadamente baja

Campo magnético de frecuencia extremadamente baja

Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa

gegahercios

Clasificación celular activada por fluorescencia

Comida y droga

Fase de reposo

Fase de brecha

segundo espacio

Suero Bovino Humano

Fibroblasto pulmonar fetal humano

Antígeno leucocitario humano

Células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano

hercios

Sociedad Internacional de Terapia Celular

exposición indirecta

Kilovoltio

Mitosis

Metro

Campo magnético

Miligramo

complejo mayor de histocompatibilidad

Magneto hidrodinámico

Milímetro

Imagen de resonancia magnética

Militesla

Megavatio

Pron.nanOg

Control negativo

Boro ferum de neodimio

Nanogramos

Factor de transcripción de unión a octámero-4

Solución salina tampón de fosfato

Tiempo de duplicación de la población

Campo electromagnético pulsado

Yoduro de propidio

Transportador asimétrico radioeléctrico

Ácido ribonucleico

Ribonucleasa

Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa

Rotación por minuto

Fase de síntesis

superconductor

Desviación Estándar

Samario Cobalto

SRY (región Y determinante del sexo) - caja 2

Almacenamiento de energía magnética superconductora

campo magnético estático

Tiempo

Doblando tiempo

tesla

Transformando el factor de crecimiento beta

factor tisular

terminal de visualización de vídeo

microgramo

Micro curry

microlitro

Microtesla

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Esta investigación fue apoyada por el Programa de Subvenciones de Investigación Fundamental (FRGS) FRGS/2/2013/SKK01/UPNM/02/1, 0713 subvenciones. Los autores agradecen plenamente al Ministerio de Educación Superior (MOHE) de Malasia por el fondo aprobado que hace que esta importante investigación sea viable y eficaz. Un enorme agradecimiento al Grupo de Investigación de Células Madre e Inmunidad, Laboratorio de Inmunología, Departamento de Patología, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad Putra Malaysia, Malasia, Serdang por recolectar muestras, por el uso de equipos en el Laboratorio de Células Madre y su experiencia. También deseamos agradecer al bibliotecario de la Universidad de Defensa Nacional de Malasia por su ayuda en la provisión de material.

El trabajo fue financiado por el Ministerio de Educación Superior (MOHE) de Malasia, a través de las subvenciones FRGS/2/2013/SKK01/UPNM/02/1, 0713 del Programa de Subvenciones de Investigación Fundamental (FRGS).

Unidad de Medicina Regenerativa y Órganos Bioartificiales, Universidad Nacional de Defensa de Malasia, Sungai Besi Camp, 57000, Kuala Lumpur, Malasia

Haslinda Abdul Hamid y Azizi Miskon

Grupo de Investigación de Células Madre e Inmunidad, Laboratorio de Inmunología, Departamento de Patología, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad Putra Malasia, 43400, Serdang, Malasia

Rajesh Ramasamy

Departamento de Física, Facultad de Ciencias Aplicadas y Tecnología, Universidad Tun Hussein Onn Malaysia, Pagoh Campus, KM1, Jalan Panchor, Pagoh Higher Education Hub, 84600, Muar, Johor, Malaysia

Mohd Kamarulzaki Mustafá

Institutos de Medicina Regenerativa, Facultad de Tecnologías Avanzadas en Medicina, Universidad de Ciencias Médicas de Irán, Teherán, Irán

Vahid Hosseinpour Sarmadi

Centro de Investigación Celular y Molecular, Universidad de Ciencias Médicas de Irán, Teherán, Irán

Vahid Hosseinpour Sarmadi

Departamento de Radiología Dental, Facultad de Medicina Dental, Universidad de Airlangga, Surabaya, 60132, Indonesia

Rajesh Ramasamy

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HAH ha llevado a cabo los experimentos, realizado análisis de datos, búsqueda de artículos. HAH redactó, escribió y actualizó el manuscrito con el apoyo de AM, RR, VHS y MKMAM y MKM fabricó el imán estático SmCo5 del sistema. AM, RR, VHS, MKM ayudan a supervisar el proyecto. AM concibió la idea original.

Correspondencia a Azizi Miskon.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Hamid, HA, Ramasamy, R., Mustafa, MK et al. La exposición magnética con samario cobalto (SmCO5) aumentó la proliferación y el tallo de las células madre mesenquimales del cordón umbilical humano (hUC-MSC). Informe científico 12, 8904 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-12653-z

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Recibido: 16 noviembre 2021

Aceptado: 11 de mayo de 2022

Publicado: 26 mayo 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-12653-z

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